지구정화 작용에 관한 분석

해당 기구에서 생성된 데이터는 전자 현미경 분석의 데이터를 준수했다. 혈소판 EV 단백질 바이오마커는 특성이 좋았다. LEAP 정화 pEV의 특성을 파악하기 위해 단백질 단순(Jess)의 미세 유체 웨스턴 블롯 시스템을 사용했습니다. 그 시스템은 전통적인 웨스턴 블롯보다 몇 가지 이점을 제공한다. 여기에는 샘플에서 여러 대상을 동시에 탐색하고 정확한 분자량 측정을 얻을 수 있는 기능이 포함된다. 검출된 혈소판 EV 단백질 바이오마커는 플렉사리스 LEAP 정제 제품에 EV가 포함되어 있음을 확인한다. LEAP 유도 pEV 배치에는 108개 입자당 0.167µg의 단백질 대 입자 비율이 포함되어 있었다. 이에 비해 Aatonen 등은 UC에 의해 회수된 pEVs가 108개 입자(19개)당 단백질 대 입자 비율이 3.42–29.97µg였다고 보고했다. 이러한 비교는 LEAP가 UC를 사용하여 얻을 수 있는 것보다 최대 20–180배 적은 오염 단백질로 순수 pEV 격리를 산출했음을 시사한다.우리의 목표는 EV에 적용되는 가이드라인을 준수하고 높은 양과 품질로 EV를 제조할 수 있는 LEAP 플랫폼의 능력을 확인하는 것이었다. LEAP 플랫폼에 의해 격리된 Plexaris EV의 특성을 검증하기 위해 서로 다른 보완 기법을 적용했다. 음극염색전송전자현미경(TEM)을 이용한 절연 pEV 분석 결과 구형 컵 모양의 입자가 드러났다. 이 결과는 EV 형태론의 다른 관측과 일치했다. pEV의 입자 분포와 모양을 시각화하기 위해 크라이오-TEM을 사용했다. 입자들은 예상되는 이중층 구조, 고체 코어, 단백질 부착을 보였다. 이러한 주요 특성은 유사한 EV에 대해 이전에 발표된 것과 일치한다. 플렉사리스 EV는 크기가 30nm에서 200nm 이상인 소형, 중형 및 대형 EV를 포함하는 이질 집단이었다. Spectradyne의 nCS1 입자 측정기를 사용하여 전자현미경 검사 결과를 확인하였다. 평균 저항성 펄스 감지 기능은 TS-400 칩셋을 통해 65nm에서 400nm 사이의 입자를 감지할 수 있다. LEAP 지적 재산은 EV 정화에 적용할 수 있는 교환 가능한, 구체적으로 충전된 R 그룹과 백본 화학이 많다는 사실을 발견한 것에 기초한다. LEAP 정화 프로토콜은 필터링 및 칼럼 크로마토그래피와 같은 확장 가능한 장치 작동을 기반으로 한다. 이미 일상적으로 구현된 재료와 기술을 사용해 단일 클론 항체(MABS)와 백신을 처리한다. Plexaris EV의 경우, LEAP 플랫폼은 약 70배의 집중 계수를 제공했다. EV 소스의 희석 정도에 따라 LEAP 기술은 최대 200배의 농도 계수를 제공할 수 있으므로 제조, 채우기 및 마감과 관련된 후속 초여과 및 멸균 여과 단계를 단순화할 수 있다. 플랫폼은 활성화된 혈소판 팩에서 일관된 높은 수율의 혈소판 EV(pEV)를 격리하고 회수했으며, 이는 10회 실행 시 단백질 양과 입자 수 측정에서 모두 나타났다. 격리 단계에 따라 Plexaris EV를 특성화하여 포획된 EV의 주요 생물물리학적, 생화학적 특성을 설정하였다. 일반적으로 프로세스를 결합하면 수율이 떨어지고 처리 시간이 길어진다. 면역 친화성 기반 EV 포획은 EV 모집단 표면의 특정 마커의 인식에 기초하며 EV 기반 진단에서 그 틈새를 찾을 수 있다. 그러나 면역 친화성 기반 EV 포획은 EV 정화를 위한 일반적인 플랫폼을 제공하지 않으며, 제조 규모에서 비용 부담이 클 것으로 예상된다. 단백질과 mRNA 제조를 포함한 생약 생산의 인접 분야에서는 이온 교환 크로마토그래피(IEX)가 다운스트림 처리(13)에서 핵심적인 역할을 한다. 아래에서는 EV 격리 및 정화를 위해 특별히 설계되고 검증된 독점 IEX 기반 프로토콜을 설명한다. 광범위한 업스트림 공급원에 적합하며 벤치에서 상업용 제조에 이르기까지 모든 규모에 표준 바이오 프로세싱 장비와 함께 사용할 수 있습니다. 본 연구에서 리간드 기반 EEP기술은 NEV 및 EEV 제품 제조에 적합한 효율적이고 확장성이 뛰어나며 저비용의 고도로 재현 가능한 EV 정화 플랫폼 기술임이 입증되었다. LEAP 플랫폼은 EV 포함 매체(예: 세포 배양 매체, 활성화된 혈소판 방출)에서 EV를 선택적으로 캡처(바인딩)하고 즉시 릴리스(용출)하는 것을 기반으로 합니다. EV 정화를 위한 음이온 교환 크로마토그래피(AEX)를 주로 연구하였다. 이에 비해 LEAP 기술은 양이온 교환을 기반으로 한다. EV는 순 음전하를 띄지만, 양전하의 국소 영역은 지질 이중층 구조의 외부 표면에 존재한다. LEAP 기술은 LEAP 수지 "백본"을 따라 약 5 € 간격으로 대전된 R 그룹을 사용하여 이러한 양전하와 상호작용하여 EV를 선택적으로 포착한다. 연구는 UC 프로토콜이 노동 집약적이고, 기술적으로 까다로우며, 느리며, 직접 확장되지 않는다는 것을 인정했다. UC로 가공한 EV의 무결성 및 순도, 최종제품에 남아 있는 오염 수준에 대한 우려도 제기되고 있다. 바이러스 백신 생산 등 관련 산업 전반에 걸쳐 UC는 가능한 한 단계적으로 폐지됐다. NEV 제품은 엄격한 순도 요건을 충족할 필요는 없지만, EEV는 천연 및 변형 EV의 고유한 특성을 활용하여 "화물"의 약물을 제공하도록 설계되었다. 따라서 제품 순도와 일관성이 이러한 약물 전달 차량에 중요하다. EEV 생산이 상업적 생존력을 확보하려면 UC에 대한 대체 다운스트림 처리 방법이 필요할 수 있다. 연구된 방법 중 크기 배타 크로마토그래피와 미세유체 기반(입자 크기) 접근법은 EV와 유사한 크기의 단백질 또는 기타 세포 물질의 골재가 여과액에서 공동 절연될 수 있기 때문에 확장성과 출력 순도가 부족하다. 폴리머 기반 익사체 침전 역시 스케일링이 어려울 수 있고, 순도 요구 사항을 충족하지 못하며, 폴리머 오염을 유발할 수 있다. 반면 TFF(Tangial-flow filtering)는 확장성이 뛰어나지만 단독으로 사용할 경우 제품 순도가 낮아질 수 있다. 세포외 소포(EVs)에 기초한 새로운 치료법이 최근 중요한 발전을 통과했다. 2020년 동안 바이오 제약 회사가 개발한 최초의 실험 EV 제품 중 일부는 인간 임상시험에 들어갔다. EV는 나노미터 크기의 지질로 둘러싸인 구로서 인체 내의 거의 모든 세포 유형에 의해 방출된다. EV에는 단백질, 지질, RNA 등의 화물이 실려 있고 표적 세포의 흡수를 선호하는 표면 표지가 붙어 있다. 따라서, EV는 셀 간 통신의 핵심 모드이다. 이와 같이, 그것들은 치료적으로 사용될 수 있는 흥미로운 가능성을 제공한다. 혈소판 및 줄기세포와 같은 공급원으로부터 격리된 EV는 재생 의학에 큰 관심을 가지고 있다. 가능한 NEV 적용에는 상처 치유 및 골관절염 치료가 포함된다. 수정된 EV가 표적화되고, 생체적합성이 높으며, 면역성이 없는 약물 전달 차량으로 작용할 가능성이 이미 일부 대형 제약 회사의 관심을 끌었다. 그러나 EV 치료제가 임상시험을 통해 전환되기 시작하면서 주요 개발 병목 현상이 나타나고 있다. 생물 원자로 배양 세포가 수조 대의 EV를 생산하지만, EV의 다운스트림 처리는 전통적으로 초원심분리에 기초해 왔다.